1. 摘要：

酶基疗法的应用在现代药物开发中受到了极大的关注。脂肪酶是用途最广泛的酶之一，可作为治疗药物用于基础皮肤护理和与皮脂分泌过多、痤疮和炎症相关的医学治疗。可用于皮肤治疗的传统配方，如乳霜、软膏或凝胶，被广泛应用；然而，它们的使用并不总是伴随着良好的药物渗透性能、稳定性或患者依从性。纳米配方药物提供了结合酶制剂和小分子制剂的可能性，使其成为该领域令人兴奋的新选择。在这项研究中，开发了由聚乙烯呲咯烷酮和聚乳酸制成的聚合纳米纤维基质，包埋了来自念珠菌和利佐莫科的脂肪酶以及抗生素化合物纳地沙星。研究了聚合物类型和脂肪酶的影响，并优化了纳米纤维的形成过程，为局部治疗提供了一种有前景的替代方案。我们的实验表明：静电纺丝包埋诱导脂肪酶的特异性酶活性提高了两个数量级。渗透性研究表明，所有装载脂酶的纳米纤维面膜都能够将纳氟沙星输送到人体表皮，证实了静电纺丝作为局部皮肤药物配方方法的可行性。

2. 研究亮点

本研究的目的是介绍一种通过静电纺丝技术生产的组合纳米结构面膜的原型。在本研究中，由聚乙烯吡咯烷酮的（PVP）形成的水溶性基质和由聚乳酸（PLA）形成的耐水性基质包含不同脂肪酶（CrL：褶皱假丝酵母的脂肪酶和RmL：米氏假根毛霉的脂肪酶）的固定化混合物和抗生素那氟沙星（NF）（图1）。那氟沙星主要作为局部氟喹诺酮类药物，可有效治疗革兰氏阴性、革兰氏阳性和厌氧细菌浅表皮肤感染。当作为潜在的治疗靶点用于治疗寻常座疮时，脂肪酶的作用是通过减轻患者皮脂分泌的增加来帮助活性成分的渗透。在这项研究中，脂肪酶由直接涂抹在患者面部皮肤上的纳米纤维面膜携带。在脂肪酶催化水解三种天然脂肪酸甲酶（棕榈酸、亚油酸和油酸）的过程中，研究了纳米纤维制剂对包埋脂肪酶的影响，这三种脂肪酸甲酯是人类皮肤脂质组成的主要成分。通过扫描电子显微镜和拉曼显微镜研究了纳米纤维的形态和结构均匀性，通过接触角测量和机械应力研究了纳米光纤的润湿行为和弹性。用垂直弗朗茨扩散细胞系统检测抗生素制剂的渗透性，该系统涉及从人腹部皮肤分离的热表皮。

图1 一种用于联合治疗寻常痊疮的多层纳米纤维面罩的组合物。三层面膜由两层酶负载层组成：在聚合物（PVP或PLA）纳米纤维中配制的来自皱纹念珠菌（CrL）的脂防酶和来自米黑根毛霉菌（RmL）的脂酶，以及一层具有抗菌作用的聚合物纳米纤维中配方的纳地沙星（NF）。

2.1 脂肪酶和那氟沙星在聚合物纳米纤维中的制备

第一步是评估通过静电纺丝包埋在PVP和PLA纳米纤维中的酶（CrL和RmL）和那氟沙星对纤维形态的影响，并使用扫描电子显微镜（SEM）研究所产生的纤维产物。表1显示了所研究的纳米纤维样品的平均纤维直径和标准偏差，而图2描绘了相同样品的SEM图像。电子显微镜结果的检查表明，电纺产品的结构如预期的那样是纤维状的，只有轻微的分散结构缺陷。PLA纤维的平均直径明显大于PVP纤维，直径的标准偏差同样更大，但它们的形态仍然是可接受的（表1）。在PVP的情况下，包埋的酶略微降低了初始纤维的平均纤维直径，但那氟沙星使其增加。PLA纳米纤维的纤维直径由于酶或抗生素的存在而减小。关于多层面膜，PVP和PLA基垫的纤维比“空”聚合物纤维基质的纤维更薄。

表1 不同聚合物（PVP或PLA）纳米纤维的平均纤维直径：不含负载剂、CrL、RmL或那氟沙星（NF）的纳米纤维；负载纳米纤维；以及由负载酶和抗生素的纳米纤维层构建的多层面膜。通过SEM图像的软件分析来确定纤维的直径。在每种情况下，通过测量100个独立的纤维直径来计算平均纤维直径。

图2 扫描电子显微镜（SEM）图像，描绘了含有（a）10wt%CrL的纳米纤维PVP基质的形态；（b）10wt%RmL；和（c）多层PVP面膜，其由含CrL（10wt%）的底层、含RmL（10wt%）的中间层和含那氟沙星（3wt%）的顶层组成；以及含有（d）10wt%CrL的纳米纤维PLA基质；（e）10wt%RmL；和（f）多层PLA面膜，其由含CrL（10wt%）的底层、含RmL（10wt%）的中间层以及含纳替沙星（3wt%）的顶层和中间层组成。

应用SEMI进行的形态学研究表明，所有电纺样品都具有纤维结构，具有一些不均匀性（图2）。通过研究纳米纤维的结构，我们可以得出结论，所用的前体适用于研究目的中所述产品的生产。由于前体的良好性能，在静电纺丝实验中，纤维形成在恒定参数下是稳定的，这一事实进一步支持了这一点。

2.2 .拉曼显微镜结构分析

在结构分析之后，使用拉曼图谱来检查配制剂（脂肪酶和那氟沙星）在各种纳米纤维中的分布。在每种纤维的情况下，第三组随机选择一个100x100μm表面的区域进行研究，以确定那氟沙星和不同脂肪酶（CrL和RmL）的分布（图3）。对初始组分的化学结构进行了研究，目的是在脂肪酶和那氟沙星的拉曼光谱特征中找到独特的光谱截面，为制剂的定位提供参考。非包埋脂肪酶和那氟沙星的拉曼光谱被用作配方制剂定位的参考，它们的出现频率如化学图谱所示，代表了特定化学实体的统计分布。对于那氟沙星谱图，1550 ^cm-1处的拉曼峰被归属于喹诺酮环系统的拉伸振动，1617 ^cm-1的拉曼带被归属于芳香环的C=C不对称拉伸振动，作为与其他成分相比独特的光谱振动。在含有组合酶组合物的纤维垫的情况下，由于聚合物基质的掩蔽，包埋酶的分化具有挑战性。因此，基于主要蛋白质结构元素（酰胺I）进行分析，其不与其他成分的任何其他光谱振动重叠。酰胺I区（1600-1700 ^cm-1) 羰基伸缩的振动带显示出较强的拉曼强度，这与脂肪酶的二级结构相对应。在拉曼光谱中（图3），特征酰胺I带主要来自脂肪酶肽基的C-O伸缩振动。对于应用的两种酶，都可以清楚地观察到Cl-螺旋（1667 cm^-1）和β片（1719 ^cm-1）。除了酰胺I区外，还可以观察到酶的蛋白质结构中的C-H弯曲（1512 ^cm-1）和酷胺III区1147 cm^-1。

图3 初始组分NF、那氟沙星的拉曼光谱；PVP、聚乙烯吡咯烷酮；PLA，聚乳酸；RmL，产自三木霉的脂肪酶；和来自皱纹念珠菌的脂肪酶CrL。

在对初始组分的结构进行检查后，进行拉曼图谱分析，以研究那氟沙星和不同脂肪酶在纤维垫中的分布。对于定位，前面提到的光谱区域被用作其出现频率如化学图所示，化学图代表特定化学实体的统计分布（图4）。化学图谱的不同颜色表示纳米纤维中所研究组分的相对强度变化。红色表示其强烈存在，绿色区域表示混合成分，而蓝色表示地图中光谱分辨率包含另一成分不同光谱特征的区域。结果表明.在这两种聚合物的情况下，那氟沙星以及不同脂肪酶的分布是均匀的，如黄红色的明确包装所示。

图4 从各种PVP和PLA基电纺非织造组织的三个不同位置随机选择的区域的拉曼化学图谱，表明包埋在其中的脂肪酶和那氟沙星的分布和相对发生：（a）PVP纳米纤维基多层面膜中的RmL和CrL分布，（b）PVP纳米纤维基多层面膜中的那氟沙星分布；（c）在基于PLA纳米纤维的多层面膜中的RmL和CrL分布，以及（d）那氟沙星（NF）PLA纳米纤维多层面膜中的分布。

通过扫描总样品的三个不同区域，还研究了不同化学实体（属于脂肪酶和那氟沙星）的分布。通过图像计算器测量每个拉曼图谱中红色像素的总面积（其中检测到活性化合物的强烈存在），并绘制从同一纤维毡记录的三个拉曼图谱的平均值（图5）。随机记录的拉曼图谱的相对低的标准偏差表明脂肪酶和那氟沙星都均匀分布在所研究的纳米纤维中。

图5 脂肪酶(RmL和CrL)和那氟沙星（NF）在PVP和PLA纳米纤维中的分布表明，基于其特定拉曼强度，酶或抗生素剂强烈存在。

3. 结论

在这项研究中，使用静电纺丝技术开发了一种新型纳米结构面膜的原型。通过测序生产具有不同负载量的三个纳米纤维层，例如两种类型的脂肪酶（分别来自皱褶假丝酵母和米氏假根毛霉的脂肪酶CrL和RmL）和抗生素制剂那氟沙星可以实现组合配方。为了证明这些面膜的潜在适用性，制备并研究了水溶性和不溶性聚合物、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乳酸（PLA）纳米纤维层作为这种面膜的候选结构材料。结果表明包埋是成功的，包埋的脂肪酶在三种天然脂肪酸（棕酸、油酸和亚油酸）甲酯的酶催化水解中具有比天然形式高两个数量级的比酶活性。对人腹部皮肤的热分离表皮（HSE）的渗透性研究证实，所有纳米纤维面膜（简单的载有那氟沙星的面膜或与脂肪酶和那氟沙星组合的面膜）都可以将那氟沙星输送到人表皮。我们的研究结果表明，在配方中脂肪酶的活性很强，受所用基质聚合物和共同配制的药物的材料质量的影响。对活性的影响可能是由于二阶相互作用的形成和变构修饰引起的酶构象的变化，但如前所述，准确的表征需要使用计算化学方法。我们之前的研究已经表明，与环糊精添加剂的氢键对包埋在聚合物纳米纤维中的脂肪酶具有有益作用。

关于新型多材料纳米面膜的潜在适用性，寻常痤疮会导致皮肤表面皮脂生成增加，含脂肪酶的配方由于其剥落作用可以支持药物递送。由于纳米纤维对脂肪酶活性的增强作用和精细可调层的产生，静电纺丝技术可能是高级皮肤护理的独特工具。