作者及其机构：

Tong Wu , Jiajia Xue , Haoxuan Li, Chunlei Zhu, Xiumei Mo, and Younan Xia

The Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, Atlanta, Georgia 30332, United States

State Key Lab for Modification of Chemical Fibers and Polymer Materials, College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, P. R. China

School of Chemistry and Biochemistry, School of Chemical and Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology, Atlanta, Georgia 30332, United States

Periodical:

ACS Appl.Mater.Interfaces

Impact Factor:

7.504

Article info:

Received 3 January 2018

Date accepted 8 February 2018

Published online 8 February 2018

摘要：
用活性蛋白的圆形梯度功能化的支架对组织再生有吸引力，因为它们增强了加速细胞迁移和/或以放射状方式促进轴突延伸的能力。在这里，我们报道了一种在由径向排列的纳米纤维组成的支架上生成活性蛋白圆形梯度的通用方法。在一个典型的过程中，用铜线将支架的中心部分抬高成锥形，将其放置在容器中（直立或上下），然后将牛血清白蛋白（BSA）溶液滴加到容器中。因此，沿着每个纳米纤维产生BSA的圆形梯度。然后用感兴趣的活性蛋白填充BSA未覆盖的裸露区域。在展示其潜在应用时，我们使用不同的模型系统来检查两种类型的蛋白质梯度的影响。虽然层粘连蛋白和表皮生长因子的梯度分别加速了成纤维细胞和角质细胞从支架的边缘向中心的迁移，但神经生长因子梯度促进了神经突从胚胎鸡背根神经节的径向延伸。这种用于产生活性蛋白的圆形梯度的方法可以容易地扩展到不同类型的支架，以适合伤口闭合和涉及细胞迁移和/或神经突以放射状延伸的相关应用。

Results and discussion:

图1.（A）用于生成由径向排列的PCL纳米纤维组成的支架的电纺丝装置示意图。（B） 显示纳米纤维在点电极和环形电极上排列的示意图。（C） 照片显示了径向排列的PCL纳米纤维的典型样品。（D） 从支架中心部分拍摄的光学显微照片

图2.沿着径向排列的纳米纤维产生活性蛋白的圆形梯度的示意图。将等离子体处理的纳米纤维支架放置在24孔板的孔中，其中心用铜线升高4mm。然后通过以1mL/h的速率将0.1%BSA溶液泵入孔中来产生BSA梯度。然后用活性蛋白填充BSA留下的裸露区域，以产生与BSA梯度逆流的梯度。以这种方式，产生从外围向中心增加的径向梯度。类似地，使用相同的方法可以产生从中心向外围增加的相反梯度，除了中心升高的支架放置在井上向下

图3.相对荧光强度显示了通过BSA阻断产生的沿着径向排列的纳米纤维的FITC-BSA的分级或均匀涂层。插图显示了沿径向方向的相应位置示意图

图4.（A）通过CCK-8测定测试的不同类型纳米纤维支架上NIH-3T3成纤维细胞的增殖*与同一培养时间的其他组相比，P<0.05#相对于涂有分级均匀层粘连蛋白和裸纳米纤维的支架，P<0.05+与裸纳米纤维相比，P<0.05。（B） 在层粘连蛋白梯度覆盖的支架和TCP上培养的细胞在不同孵育时间的存活率*第1天与涂有分级层粘连蛋白的支架相比，P<0.05#第1天与TCP组比较P<0.05+与同一时间点涂有分级层粘连蛋白的支架相比，P<0.05

图5.荧光显微照片显示了NIH-3T3成纤维细胞在培养3天后在径向排列的纳米纤维上的迁移，所述纳米纤维分别覆盖（A）层粘连蛋白的分级涂层和（B）均匀涂层，（C）裸露的径向排列纳米纤维，和（D）层粘连素涂层TCP。细胞核用DAPI（蓝色）染色，肌动蛋白细胞骨架用Alexa Fluor 555蝴蝶啶（红色）染色。虚线表示细胞接种的边界

图6.荧光显微照片显示了在径向排列的纳米纤维上培养的NIH-3T3成纤维细胞的形态和排列，所述纳米纤维分别覆盖（A）层粘连蛋白的分级涂层和（B）均匀涂层，（C）裸露的径向排列纳米纤维，和（D）层粘连素涂层TCP。这些图像是从迁徙区拍摄的。细胞核用DAPI（蓝色）染色，肌动蛋白细胞骨架用Alexa Fluor 555蝴蝶啶（红色）染色。箭头指示纳米纤维排列的方向

图7.（A）培养3天后，覆盖层粘连蛋白、裸纳米纤维和层粘连蛋白涂层TCP的径向排列纳米纤维上迁移区不同区域的细胞数量*与覆盖均匀层粘连蛋白涂层的支架相比，P<0.05相对于裸纳米纤维和层粘连蛋白涂层TCP制成的支架，P＜0.01相对于覆盖有层粘连蛋白均匀涂层的支架、裸纳米纤维制成的支架和层粘连蛋白涂层的TCP，P＜0.01。（B） 根据不同区域中迁移的细胞数量计算的迁移指数**与在覆盖层粘连蛋白均匀涂层的支架、裸纳米纤维制成的支架和层粘连蛋白涂层TCP上培养的细胞相比，P＜0.01

图8.荧光显微照片显示角质形成细胞在径向排列的纳米纤维上的迁移，所述纳米纤维分别覆盖有（A）分级的和（B）均匀的EGF涂层，（C）被BSA梯度掩盖的径向排列纳米纤维，和（D）培养3天后的裸径向排列纳米纤丝。细胞核用DAPI（蓝色）染色，肌动蛋白细胞骨架用Alexa Fluor 555蝴蝶啶（红色）染色。虚线表示细胞接种的边界。（E） 培养3天后，不同支架上迁移区不同区域的细胞数量。（F） 根据不同区域中迁移的细胞数量计算的迁移指数与在涂有分级EGF的支架上培养的细胞相比，P<0.05和P<0.01

图9.当在分别涂覆有（A）分级NGF层和（B）均匀NGF层的径向排列纳米纤维和（C）裸露的径向排列的纳米纤维上培养6天时，从DRG体延伸的典型轴突场的荧光显微照片。轴突用Tuj1标记物（绿色）染色。箭头指示纳米纤维排列的方向。（D） 分析在不同纳米纤维支架上培养的鸡DRG体生长出的轴突的平均长度***与从DRG体向中心延伸相比，P<0.001。在覆盖有均匀NGF涂层且由裸纳米纤维制成的支架上，DRG体的两侧没有发现显著差异

结论：
总之，我们已经证明了一种简单而通用的策略，通过首先创建BSA的分级掩膜，在径向排列的纳米纤维上生成活性蛋白的圆形梯度。通过不断增加引入容器中的BSA溶液的体积，其中中心凸起的纳米纤维支架以直立或上下配置放置，可以沿着径向排列的纳米纤维产生BSA梯度。然后，用感兴趣的活性蛋白填充BSA留下的裸露区域，以产生与BSA逆流的活性蛋白的圆形梯度。这类支架能够呈现径向排列的地形线索和朝向中心或外围的蛋白质梯度的生化线索，这可以容易地适用于各种类型的活性蛋白质和聚合物支架。作为组织工程中潜在应用的证明，层粘连蛋白、EGF或NGF的圆形梯度沿着纳米纤维方向在径向排列的PCL纳米纤维上产生。我们发现，成纤维细胞或角质细胞向纳米纤维支架中心的迁移可以通过沿径向排列的层粘连蛋白或EGF梯度的存在而加速。对于涂覆有梯度NGF、DRG轴突的径向排列纳米纤维

沿着纳米纤维的径向排列延伸，并且朝向NGF含量增加延伸的轴突比在相反方向延伸的轴突长1.44倍。总之，这些研究为设计生物化学分级支架提供了宝贵的信息，该支架与径向排列的地形线索相结合，可用于伤口闭合和需要细胞迁移和/或神经突径向延伸的相关应用。

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